iLOCS

Entwicklung eines mobilen molekulardiagnostischen, integrierten Lab-on-Chip-Systems (iLOCS) für die schnelle molekulare Diagnostik nosokomialer Infektionen

G. Dame1 ; M. Hügle 1,2; G. A. Urban 2 ; F.T. Hufert 1
1Institut für Mikrobiologie und Virologie, Medizinische Hochschule Brandenburg ( MHB)
2 Universität Freiburg, IMTEK, Lehrstuhl für Sensoren

Hintergrund

Die Infektion mit Norovirus ist eine der häufigsten Ursachen der akuten infektiöse Gastroenteritis in Europa. Neben Noroviren stellen Infektionen mit C. difficile Infektionen (CDI) ein zunehmendes Problem dar, insbesondere nach Behandlung mit Antibiotika. Das klinische Spektrum der CDI reicht von einer leichter Diarrhoe bis hin zu schweren lebensbedrohlichen pseudomembranöser Kolitis. Beiden Erregern ist gemein, dass Sie ein zentrales Problem im Hygienemanagement von Krankenhäusern und in jeder Art von Gemeinschaftseinrichtungen darstellen. Nur eine sehr zeitnahe Schnelldiagnose kann helfen die Verbreitung der Erreger zu verhindern und so einen Ausbruch zu stoppen.

Unser Ziel ist die Entwicklung eines mobilen molekulardiagnostischen integrierten Lab-on-Chip-Systems (iLOCS) in Laptopgröße für die schnelle Diagnose von Infektionskrankheiten. Basierend auf der isothermen Genamplifikationstechnik der Rekombinase-Polymerase-Amplifikations-Assays (RPA) entwickeln hierfür wir molekulare Nachweisverfahren. Im Vergleich zu Standard-Echtzeit-PCR-Verfahren liefert die RPA unter Verwendung einer energiearmen isothermen Amplifikation ein Ergebnis schon innerhalb von 5 bis 15 Minuten wohingegen die Standard-PCR 1-2 h benötigt.

Hier zeigen wir die Ergebnisse zweier RPA-Verfahren zum molekularen Schnellnachweis von Norovirus und C. difficile. Darüber hinaus präsentieren wir die ersten Ergebnisse unserer Ingenieurarbeiten zur RPA-basierten Lab-on-Chip-Entwicklung. In Zukunft soll iLOCS auf RPA-Basis auch zur Diagnostik weiterer Krankheitserreger eingesetzt werden und könnte bisherige diagnostische PCR-Verfahren ersetzen.

Methoden

Basierend auf Genbankdaten wurden qPCR und RPA-Primer und Sonden für C. difficile (Tox A und B) und Norovirus (GGI, GGII) erstellt. Die Primer-Sets für die qPCR- Verfahren wurden auf einem LightCycler 480 (Roche) getestet, wohingegen Primer und Sonden des isothermen RPA-Verfahrens in dem RPA-Reader (Tube-Scanner, ESE) analysiert wurden. Um die Empfindlichkeit der Testverfahren zu bestimmen, wurde eine Probit-Analyse mit acht verschiedenen Durchläufen unter Verwendung unserer synthetischen RNA- oder DNA-Standards durchgeführt. Die Spezifität der Testverfahren wurde mit dem NATtrol GI-Panel (ZeptoMetrix) getestet.

Norovirus

Abbildung 1. Norovirus RPA, Sensitivitätsanalyse unter Verwendung von RNA-Run-off-Transkripten (acht Läufe), Norovirus GGI Sensitivität: 10 1 -10 2 Genome/µl.

Ergebnisse
Molekulardiagnostische Verfahren

Es wurden RPA-Testverfahren für Norovirus und für das Toxin-B-Gen von C. difficile entwickelt. Die Spezifität aller RPA-Verfahren lag bei 100%. Die Sensitivität der RPA-Verfahren zum Nachweis von Norovirus und C. difficile Toxin B lagen jeweils bei mindestens 102 Genomen/µl. Exemplarisch ist das Ergebnis des Norovirus-RPA-Tests in Abbildung 1 dargestellt. Die Ergebnisse der RPA sind mit denen der Echtzeit-PCR-Verfahren hinsichtlich Sensitivität und Spezifität vergleichbar. Darüber hinaus wurde, unter Verwendung der molekularen Standards, der Lab-on-Chip auf seine RPA-Eignung getestet und die Ergebnisse mit dem RPA- Standardverfahren (Tube-Scanner) verglichen. Die Ergebnisse sind Abbildung 2 dargestellt.
Für die Konstruktion von iLOCS wurde ein Chip zur Reinigung und Konzentration von Nukleinsäuren mit zwei integrierten Platinelektroden und drei Hydrogelen entwickelt. Des Weiteren haben wir ein Netzteil sowie einen in Abbildung 3 gezeigten Chiphalter konstruiert.
Mit unseren RPA-Standards wurde der Lab-on-Chip auf RPA-Eignung getestet. Die Ergebnisse wurden mit dem Referenzsystem des Tube-Scanners verglichen (siehe Abbildung 2).

vergleich

Abbildung 2: Vergleich der C. difficile RPA unter Verwendung des Tube-Scanners (rote Linie) und des Lab-on-Chip-System (blaue Linie) auf der Basis von 5x 106 Genomkopien.

iLOCS-Entwicklung

Für die Konstruktion von iLOCS wurde ein Chip zur Reinigung und Konzentration von Nukleinsäuren mit zwei integrierten Platinelektroden und drei Hydrogelen entwickelt. Des Weiteren haben wir einen spezifischen Spannungsgeber sowie einen in Abbildung 3 gezeigten Chiphalter konstruiert.

Schlussfolgerung

Ziel dieses Projektes war die Entwicklung eines RPA- basierten molekularen Nachweissystems für den schnellen Nachweis von Norovirus und Clostridium difficile Toxin B. Ein solches Schnelltestverfahren könnte in der ambulanten und stationären medizinischen Versorgung breit angewendet werden, um Erkrankungen Ausbrüche mit diesen Mikroorganismen zu verhindern.

Schnelle und zuverlässige Diagnostiksysteme die ein Ergebnis im Sample-to-Result-Format liefern, können die Arbeitsbelastung in Diagnostiklaboren reduzieren, die Hands-on-Time verkürzen und ermöglichen auch eine Labortestung durch den Patienten zu Hause. Die Datenübertragung an ein eHealth-Center ermöglicht hierbei auch die ärztliche Validierung in Echtzeit.

POCT-Molekulardiagnostiksysteme bieten auch neue Möglichkeiten zur Diagnose von Infektionskrankheiten (ID) in Ländern mit niedrigen Gesundheitsstandards, bei jeder Art von Feldmissionen oder bei der Untersuchung von Ausbrüchen. Der Einbau in ein „Kofferlabor“ bietet hierbei eine einfache und kostengünstige Option für die schnelle molekulare ID-Diagnose in Ländern mit geringen Ressourcen.

Mikrofluidischer

Abbildung 3. Links: Mikrofluidischer Chip zur Ankonzentration und Bakterienlyse sowie für die nachgeschaltete Nukleinsäureaufreinigung mittels Gelelektrophorese. Rechts: CNC-gefräste, kundenspezifischen Chiphalter.

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